L'ingegneria genetica offre all'umanità l'opportunità di creare organismi precedentemente inesistenti e di distruggere le malattie genetiche. Tuttavia, le cose non sono così rosee, dal momento che anche la rivoluzionaria tecnologia CRISPR / Cas9 è lungi dall'essere perfetta. Gli errori che fa possono essere rari, ma uno è sufficiente per diventare fatale per una persona. Lenta.ru parla di cosa c'è di sbagliato in CRISPR e di come gli scienziati stanno cercando di risolvere la situazione.
Il sistema CRISPR / Cas9 - una sorta di forbici del DNA - è giustamente considerato una rivoluzione nel campo dell'ingegneria genetica. Con il suo aiuto, gli scienziati possono modificare il genoma umano, rimuovendone le mutazioni dannose e quindi curare malattie ereditarie spiacevoli e mortali. Non si dovrebbe pensare, tuttavia, che prima non esistessero tali metodi. Nell'arsenale dei genetisti c'erano, ad esempio, nucleasi contenenti "dita" di zinco ed endonucleasi, enzimi che rompono le molecole di DNA in punti specifici. In termini di precisione, versatilità e costo, sono notevolmente inferiori a CRISPR / Cas9, sebbene quest'ultimo sia lungi dall'essere perfetto.
CRISPR / Cas9 è stato originariamente creato non dagli scienziati, ma dalla natura. È un meccanismo molecolare all'interno dei batteri che consente loro di combattere i batteriofagi e altri parassiti. In effetti, funziona come un'immunità contro le infezioni. CRISPR (sta per "brevi ripetizioni palindromiche, regolarmente distanziate in gruppi") sono regioni speciali (loci) del DNA. Contengono brevi frammenti di virus a DNA che una volta infettavano gli antenati dei batteri di oggi, ma sono stati sconfitti dalle loro difese interne. Questi pezzi sono chiamati distanziatori e sono separati l'uno dall'altro ripetendo sequenze.
Quando un batteriofago invade un batterio, ogni sequenza ripetuta e spaziatore adiacente vengono utilizzati come stampo per la sintesi di molecole chiamate crRNA. Si formano tante catene di RNA diverse, che si legano alla proteina Cas9, il cui compito è estremamente semplice: tagliare il DNA del virus. Tuttavia, sarà in grado di farlo solo dopo che il crRNA avrà trovato un frammento complementare di DNA virale. Dopo che Cas9 rompe l'acido nucleico estraneo, quest'ultimo viene completamente distrutto da altre nucleasi.
CRISPR / Cas9 va bene proprio per la sua accuratezza, perché per i batteri il corretto funzionamento del sistema immunitario è una questione di vita o di morte. Il sistema "anti-virus" ha bisogno di trovare una sezione del DNA virale tra un milione di altri e, soprattutto, di non confonderlo con il proprio genoma. In milioni di anni di evoluzione, i batteri hanno perfezionato questo meccanismo. Quindi, subito dopo aver capito perché era necessario un sistema CRISPR, si sono resi conto che poteva essere addomesticato come uno strumento di modifica genetica senza precedenti.
Per sostituire una regione specifica del genoma con un'altra, è necessario sintetizzare l'RNA guida, che è simile in linea di principio al crRNA. Indica a Cas9 dove è necessario effettuare una rottura a doppio filamento nel DNA dell'organismo modificato. Tuttavia, non è necessario rovinare il gene, ma modificarlo, ad esempio sostituire uno o più nucleotidi e rimuovere la mutazione dannosa. Qui la natura viene di nuovo in soccorso. I meccanismi di riparazione naturale iniziano immediatamente a ripristinare la catena tagliata. Il trucco è che per fare ciò, alcuni frammenti di RNA vengono rimossi vicino alla rottura, dopodiché vengono inserite sequenze simili. Gli scienziati possono sostituirli con le proprie sequenze di DNA e quindi modificare il genoma.
Rappresentazione schematica di CRISPR
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Immagine: Kaidor / Wikipedia
Tuttavia, niente è perfetto. Nonostante la sua relativa accuratezza, CRISPR a volte commette errori. Uno dei motivi risiede nella natura stessa del sistema. È svantaggioso per i batteri che il crRNA coincida del 100% con un frammento di DNA virale, che può differire di uno o due nucleotidi. È meglio per lei che alcuni nucleotidi possano essere diversi, il che dà al microrganismo una migliore possibilità di combattere l'infezione. Allo stesso tempo, nell'ingegneria genetica, la bassa specificità minaccia di errori: le modifiche possono essere apportate nel posto sbagliato. Se ciò accade nel corso degli esperimenti sui topi, non ci sarà una tragedia speciale, ma la modifica del genoma umano potrebbe trasformarsi in un disastro.
Questo spiega la preoccupazione degli scienziati occidentali per gli esperimenti che vengono condotti in Cina. I ricercatori asiatici hanno utilizzato la tecnologia CRISPR per modificare geneticamente gli embrioni umani. Tali esperimenti sono stati vietati in Europa e negli Stati Uniti, ma recentemente il Regno Unito li ha autorizzati - esclusivamente per scopi di ricerca. Tali embrioni dovranno essere distrutti entro un paio di settimane dal ricevimento, il che esclude l '"allevamento" di persone GM.
Tuttavia, CRISPR / Cas9 non sarebbe così eccezionale se non potesse essere migliorato. Quindi, gli scienziati hanno insegnato a Cas9 a tagliare non due catene contemporaneamente, ma solo una. Il taglio viene eseguito in due punti diversi nella sequenza del DNA su filamenti diversi, quindi il sistema deve essere in grado di riconoscere il doppio dei nucleotidi rispetto al normale, rendendolo più preciso.
Proteine Cas e crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Gli scienziati dell'Università dell'Ontario occidentale hanno trovato un altro modo per migliorare questa tecnologia. Hanno cercato di risolvere il problema della riparazione del DNA tagliato. Il rapido ripristino della catena dell'acido nucleico porta al fatto che gli scienziati non hanno il tempo di apportare le proprie correzioni al genoma. Si crea così un circolo vizioso: la catena, riparata in modo indesiderato, deve essere nuovamente tagliata con la proteina Cas9.
Per evitare che ciò accada, i ricercatori hanno modificato le forbici proteiche per creare la proteina TevCas9. Taglia il filamento di DNA in due punti, rendendo difficile la riparazione del sito. Per la sintesi di un nuovo enzima, l'enzima I-Tevl è stato aggiunto a Cas 9, che è anche un'endonucleasi, cioè una proteina che scinde una molecola di DNA nel mezzo, piuttosto che staccare le estremità della sequenza, come fanno le esonucleasi. La proteina di fusione risultante si è rivelata più precisa nel legarsi a siti specifici e meno probabilità di commettere un errore e tagliare il sito sbagliato.
Struttura cristallina di Cas9 legata al DNA
Foto: progetto wiki Cas9 / Wikipedia
C'è un altro modo per migliorare la precisione dei sistemi CRISPR. La "corsa agli armamenti" tra batteri e virus ha portato non solo allo sviluppo di sistemi di difesa nei microrganismi, ma anche a modi per neutralizzarli. Pertanto, i batteriofagi mutano rapidamente, perdendo le aree in cui l'immunità batterica li riconosce. Tuttavia, alcuni codificano per proteine anti-CRISPR, interferendo con il lavoro del complesso crRNA-Cas9.
L'8 dicembre, la rivista Cell ha pubblicato un articolo di scienziati dell'Università di Toronto che hanno creato "anti-CRISPR", un sistema che consente di disattivare il meccanismo in determinate condizioni. Previene gli errori indesiderati sopprimendo l'attività di Cas9 nel caso in cui l'RNA guida si leghi al frammento sbagliato. Anti-CRISPR è costituito da tre proteine che inibiscono la nucleasi e sono codificate dai geni di uno dei virus batterici.
La tecnologia CRISPR viene già utilizzata per il trattamento di malattie gravi come la leucemia e il cancro ai polmoni e viene anche testata per purificare le cellule immunitarie dall'HIV. Man mano che gli scienziati trovano nuovi modi per migliorare questo metodo, si apriranno sempre più opportunità per la sua applicazione.
Alexander Enikeev
