Campioni di tessuti delle mummie con i nomi "Maria" e "Vavita" sono stati inviati dal Perù a un laboratorio russo per la ricerca. I campioni forniti di tessuti biologici sono stati studiati mediante microscopia elettronica a scansione, spettri Raman, ICPE ed è stata studiata la composizione della farina fossile (una sostanza sulla superficie della pelle delle mummie). È stato inoltre effettuato uno studio del DNA dei tessuti trasferiti.
preparazione del campione
Campioni di tessuto, 500 μg ciascuno, sono stati trasferiti in tubi di plastica e sciolti in 1 ml di tampone (Tris-HCl 10 mM pH = 10,5, EDTA 1 mM, NaCl 0,15 M). Alle sospensioni risultanti, è stato aggiunto Na dodecil solfato allo 0,5%, riscaldato a +80 ° C e, dopo 10 minuti, la proteinasi K (fino a 500 μg / ml) è stata posta in un termostato (+55 ° C) per 24 ore.
La deproteinizzazione è stata effettuata con il metodo fenolico: aggiungendo fenolo in uguale volume alla sospensione, quindi fenolo: cloroformio (1: 1), cloroformio; dopo ogni aggiunta si effettuava agitazione costante su rotore angolare e centrifugazione a 15mila rpm, 10 min.
Al super-sedimento ottenuto dopo la 3a centrifugazione è stata aggiunta 1/10 parte del volume di 1 M NaCl e 2,5 volumi di alcool etilico due volte distillato, e lasciati per una notte a -30 ° C in provette coniche - "Eppendorf". La centrifugazione è stata effettuata a 15mila vol. min. entro 10 minuti e ha ricevuto DNA "precipitato" sotto forma di un precipitato marrone. Il pellet di DNA è stato lavato due volte con alcol etilico al 70% ed essiccato a temperatura ambiente (1 ora) e quindi sciolto in tampone TE.
La PCR è stata eseguita su un termociclatore programmabile "My Cycler" ("Bio = Rad") utilizzando oligoprimeri standard sintetizzati con il metodo in fase solida presso l'associazione "Beagler" (San Pietroburgo). La miscela di reazione per l'amplificazione con un volume di 25 μL includeva: 15 nM di ciascun oligoprimero, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 a +25 C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 mercaptoetanolo, 170 μg / ml di BSA e una miscela di quattro dNTP di base a una concentrazione di 1,0 mM ciascuno e DNA polimerasi termostabile Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Dopo la denaturazione (10 min, 94 C), sono stati eseguiti 35 cicli di amplificazione per ciascun sistema di test: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Per controllare la specificità, sono stati introdotti nella reazione campioni di DNA con genotipi noti per i loci studiati (sistemi di marcatori), nonché campioni di controllo.contenente una miscela di reagenti senza DNA. Dopo l'amplificazione, un tampone di colorazione è stato aggiunto alle aliquote della miscela di reazione (7 μl) e separato mediante elettroforesi verticale in gel di poliacrilammide al 6% (210x150x1 mm), colorato con bromuro di etidio e fotografato sotto luce ultravioletta. Per identificare gli alleli, sono stati utilizzati standard allelici corrispondenti a questi loci ("ladder").
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Analisi del DNA
Per lo studio, abbiamo utilizzato il metodo di analisi dell'esoma del DNA umano basato sul sequenziamento ad alto rendimento con arricchimento mediante ibridazione.
Tecnica di analisi dell'esoma del DNA umano.
Sono stati analizzati 2 campioni … Tutte le fasi della preparazione del campione prima della PCR sono state eseguite in camere bianche. La preparazione del campione, l'estrazione del DNA e l'amplificazione dei singoli frammenti di DNA sono state eseguite in stanze diverse.
Adattatori specifici (KAPA Library Preparation Kit e SeqCap Adapter Kit; Roche) sono stati ligati alle estremità del DNA frammentato genomico (~ 5 ng), dopodiché è stata effettuata una selezione in due fasi di frammenti nell'intervallo di lunghezza di 200-350 bp utilizzando le sfere AMPureXP (Beckman Coulter) … I frammenti risultanti sono stati amplificati con primer specifici dell'adattatore e ibridati con sonde specifiche biotinilate (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) per 28 ha 47 ° C. In una reazione, sono stati combinati due campioni di DNA. Gli ibridi sonda-DNA biotinilati sono stati isolati e purificati con particelle magnetiche coniugate con streptovidina; è stata eseguita una seconda amplificazione e valutazione qualitativa della libreria di DNA risultante (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Al fine di rimuovere frammenti di amplificazione off-target e dimeri adattatori, la libreria di DNA è stata ri-purificata utilizzando particelle magnetiche di sfere AMPureXP (Fig. 1). La concentrazione finale della libreria preparata è stata valutata su uno strumento Quantus utilizzando un kit commerciale QuantiFluor® dsDNA System (Promega). La libreria di DNA risultante è stata immobilizzata sulla superficie della cella a flusso. Il sequenziamento è stato eseguito sulla piattaforma Illumina utilizzando una cella a flusso standard e MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cicli). La libreria di DNA risultante è stata immobilizzata sulla superficie della cella a flusso. Il sequenziamento è stato eseguito sulla piattaforma Illumina utilizzando una cella a flusso standard e MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cicli). La libreria di DNA risultante è stata immobilizzata sulla superficie della cella a flusso. Il sequenziamento è stato eseguito sulla piattaforma Illumina utilizzando una cella a flusso standard e MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cicli).
Figura: 1
Valutazione generale della qualità del DNA sequenziato
Per la valutazione iniziale della qualità sono stati utilizzati metodi standard come FastQC e i programmi Jellyfish e KraTER. La valutazione della qualità non ha mostrato problemi di qualità con le letture del DNA sequenziate per entrambi i campioni. Le immagini non vengono mostrate in quanto non sono informative.
Per il primo campione (ulteriore M, grande mummia "Maria") sono state sequenziate 113,4 M letture, per il secondo campione (ulteriore W, piccola mummia "WaWita") sono state sequenziate 22,9 M letture.
Il passaggio successivo consisteva nel ripulire le letture sequenziate da varie sequenze tecniche che avrebbero interferito con ulteriori analisi. Per questo, è stato utilizzato il programma Cookiecutter. Dopo la pulizia, ci sono state 113,3 milioni di letture (99%) e 22,8 milioni di letture (99%), rispettivamente, per M e W.
Stima della quantità di DNA antico e sua separazione dal moderno
Il metodo standard per valutare la presenza e la quantità di DNA antico è stimare la quantità di nucleotidi danneggiati dal tempo. Per questo, è stato utilizzato il programma MapDamage 2.0. MapDamage 2.0 che ha mostrato la quantità di DNA antico nel 30,1%, ma poiché MapDamage implica che stiamo usando un riferimento stretto e non sappiamo esattamente quanto siano vicini entrambi i campioni al genoma degli esseri umani moderni, e abbiamo usato una libreria di esomi, questo metodo non lo era sufficiente. Un altro buon metodo per valutare il DNA antico è il numero di brevi frammenti.
La filtrazione del presunto DNA antico è avvenuta in tre fasi. Nella prima fase, abbiamo rimosso tutte le letture accoppiate che non possono essere incrociate e assemblate in una lettura non accoppiata con una sovrapposizione. Queste letture indicavano che il frammento originale che era stato sequenziato era più lungo di 300 bp. e molto probabilmente DNA moderno. Quindi, dopo questo passaggio, sono rimasti rispettivamente l'86,9% e il 91,8%. Successivamente, sono stati selezionati singoli frammenti sovrapposti in modo che la loro lunghezza fosse inferiore a 150 bp, poiché questa è la lunghezza che ci aspettavamo per il DNA antico. Dopo questo passaggio, sono rimasti rispettivamente l'8,6% e il 38,5% per i campioni M e W. Va notato che nonostante la differenza in percentuale, il numero assoluto di letture tra i campioni M e W è molto simile: 9,8M e 8,8M, il che può essere spiegato dal fatto che il contenuto di DNA antico in entrambi i campioni è simile.
| Parametro | Campione M (Maria) | Campione W (Wawita) |
| Numero di letture | 113.3M | 22,8 milioni |
| Percentuale di frammenti brevi <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Percentuale di frammenti brevi <150 bp (numero) |
8,6% (9.846.035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Percentuale di frammenti allineati per genoma umano (numero) |
2,03% (2.345.084) |
9,65% (2.264.551) |
| Percentuale di frammenti allineati per genoma umano da brevi <150 bp | 23,8% | 25,6% |
Ottenere DNA simile al genoma umano di riferimento
Il presunto DNA antico risultante è stato mappato su un genoma umano di riferimento utilizzando una pipeline di ricerca di varianti genomiche standard utilizzando BWA, samtools e Wcftools.
Inoltre, solo il 23,8% del campione M e il 25,6% sono stati mappati con successo sul genoma di riferimento degli esseri umani moderni. Allo stesso tempo, per entrambi i campioni, il 75% delle letture sequenziate non poteva essere mappato sul genoma umano. Ciò può essere spiegato sia dalla contaminazione sia dal fatto che questi campioni si trovano abbastanza lontano dal genoma degli esseri umani moderni. Allo stesso tempo, vale la pena tenere presente che abbiamo sequenziato la libreria degli esomi e quindi ridotto al minimo la contaminazione del DNA batterico.
L'analisi di ricognizione iniziale delle letture crude ha mostrato che alcune di esse appartenevano a DNA ripetitivo specifico degli ungulati, questo può essere spiegato dal fatto che il grasso di lama è stato utilizzato nella mummificazione.
Un'analisi più dettagliata richiede circa tre settimane di calcoli, poiché le soluzioni esistenti sono state realizzate solo per genomi virali e batterici, e dobbiamo confrontarci con tutti i genomi esistenti, compresi i genomi delle piante, per capire quali specie sono state sequenziate.
Caratteristiche delle opzioni trovate
Le letture mappate sono state utilizzate per cercare varianti che distinguono i campioni M e W dal genoma umano moderno, nonché per valutare la contaminazione delle letture dal cromosoma Y umano.
La prima domanda a cui bisognava rispondere era su quali cromosomi erano mappate le letture sequenziate.
Poiché sappiamo che i campioni di Maria erano isolati da ossa e muscoli, e quelli di Vavita solo dalle ossa, ci aspettavamo una differenza nella quantità di mtDNA. Ma non c'era molta differenza.
Il numero di letture mappate su Y è un altro test per la contaminazione da parte degli esseri umani moderni. È interessante notare che si è rivelato lo stesso in entrambi i campioni.
Di seguito sono riportate le statistiche per le varianti trovate:
| parametri | Campione M (Maria) | Campione W (Wawita) |
| Numero di opzioni trovate | 79.957 | 48941 |
| Numero di opzioni su Y | 534 | 541 |
| Il numero di opzioni affidabili (più di 20 letture e più di 30 qualità) | 16969 | 6181 |
| Varianti con rsid noto (disponibile nel database snip) | 5701 | 3089 |
| Opzioni valide generali | 92 | |
| opzioni comuni con rsid | 49 |
Dopodiché, è diventato possibile rispondere alla domanda: M e W sono parenti? La risposta è no.
Sono state trovate solo 49 varianti corrispondenti tra M e W e 3040 diverse per varianti con rsid noto. Inoltre, forse questi sono diversi tipi o sottospecie di una persona o di una creatura sconosciuta.
È interessante notare che le varianti con il cromosoma Y sono identiche per entrambi i campioni, il che indica la contaminazione da parte della stessa persona, e che nell'antico DNA del cromosoma Y probabilmente non c'è ancora nessun cromosoma.
Valutazione della somiglianza con i genomi umani sequenziati esistenti dal 1000 Human Genome Project
Si noti che questa è solo un'analisi approssimativa, poiché per un'analisi più accurata, sono necessarie varianti da regioni del genoma sotto selezione neutra e abbiamo dati sull'esoma.
Tuttavia, utilizzando 5708 varianti per M o 3096 per S, è stato possibile effettuare una variante dell'analisi rispetto ai dati di 1000 genomi umani.
Il risultato dell'analisi PCA nell'immagine sottostante è una sovrapposizione di due immagini per M e W, calcolate separatamente, poiché ci sono troppo poche opzioni comuni tra M e W per stimare le distanze tra M e W.
Punteggio di somiglianza.
Come puoi vedere, non c'è coincidenza con nessun gruppo di geni, differiscono anche l'uno dall'altro. Ma va tenuto presente che abbiamo utilizzato sequenze di codifica sotto selezione e si consiglia di utilizzare varianti sotto selezione neutra.
Tuttavia, il risultato PCA è in buon accordo con la verifica manuale delle varianti, che ha mostrato che i dati sono in un omozigote non referenziato, il che indica ancora una volta che le immagini sono lontane dal moderno genoma umano.
Conclusione
Purtroppo eravamo limitati a due soli campioni, solitamente in questo tipo di analisi se ne utilizzano di più, almeno 3-10 almeno in qualche modo correlati. Pertanto, è necessario continuare la ricerca con un gran numero di campioni.
Allo stesso tempo, molto probabilmente possiamo concludere che i campioni di DNA di Mary e Vavita corrispondono al DNA umano, ma non coincidono con il DNA a nostra disposizione dal database di 1000 persone.
Autori del rapporto: Baranov V. S. e Aseev M. V. (Istituto di ricerca scientifica di ostetricia e ginecologia, dipartimento di diagnostica prenatale), Glotov A. S. e Glotov O. S. (Università statale di San Pietroburgo), A. S. Komissarov (Istituto di citologia, Accademia russa delle scienze, Centro di bioinformatica genetica).
Materiali forniti da Konstantin Georgievich Korotkov (dottore in scienze tecniche, professore, Università di tecnologie dell'informazione, meccanica e ottica) e Dmitry Vladislavovich Galetsky (candidato di scienze mediche, I. P. Pavlov, First St. Petersburg State Medical University).
Per ulteriori informazioni sulle mummie di Nazca, vedere il tag: Mummie di Nazca.
