Gli scienziati hanno grandi speranze per la tecnologia CRISPR / Cas9, che consente cambiamenti ad alta precisione nei genomi degli organismi viventi, compresi gli esseri umani. Vengono pubblicati tutti i nuovi articoli scientifici che descrivono vari tipi di sistemi CRISPR e le loro modifiche. "Lenta.ru" racconta le scoperte in questa zona, fatte nel 2016.
Migliaia di loro
CRISPR / Cas9 è un sistema immunitario adattivo batterico che consente ai microrganismi di combattere i virus. Consiste di distanziatori - sezioni di DNA corrispondenti a determinati frammenti (protospacer) del DNA dell'agente infettivo. Gli spaziatori codificano specifiche molecole di crRNA che si legano all'enzima Cas9. Il complesso risultante si attacca alla catena del DNA del virus e Cas9 funziona come un paio di forbici, tagliandolo.
In effetti, CRISPR / Cas9 è solo uno dei tanti sistemi simili che hanno batteri e archei. Gli scienziati li dividono in due classi. La prima classe include i sistemi CRISPR di tipo I, III e IV, e la seconda - II e V. Il tipo II contiene la proteina Cas9 coinvolta nell'acquisizione di nuovi spaziatori, nell'accumulo di crRNA nella cellula e nella scissione del DNA. In altri sistemi, per questi scopi vengono utilizzati complessi multiproteici. Ciò rende il tipo II il tipo più semplice di sistema CRISPR adatto alle esigenze di ingegneria genetica.
I tipi possono, a loro volta, essere suddivisi in sottotipi a seconda di quali geni aggiuntivi sono associati a CRISPR. Ad esempio, i sistemi IIA contengono il gene csn2, che codifica per una proteina che si lega al DNA ed è coinvolta nell'acquisizione di spaziatori. Nei sistemi IIB, csn2 è assente, ma esiste un gene cas4, la cui funzione è ancora sconosciuta, e i sistemi IIC non hanno né csn2 né cas4.
Tesori dentro i batteri
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Tutti i sistemi CRISPR conosciuti sono stati scoperti dagli scienziati in batteri coltivati in condizioni di laboratorio. Tuttavia, esiste un numero enorme di microrganismi incolti, che includono sia archaea che batteri. Di solito vivono in condizioni estreme: sorgenti minerali o corpi idrici tossici in miniere abbandonate. Tuttavia, i ricercatori possono isolare il DNA da loro e identificare regioni specifiche in esso. In un nuovo articolo pubblicato su Nature il 22 dicembre, i genetisti dell'Università della California, Berkeley, hanno decodificato i genomi delle comunità microbiche naturali, scoprendo altre variazioni del sistema CRISPR.
Batteriofago: un virus che infetta i batteri
Immagine: Giovanni Cancemi / Depositphotos
Gli scienziati sono riusciti a scoprire che alcuni tipi di nanoorganismi archeologici poco studiati ARMAN possiedono anche CRISPR / Cas9, sebbene in precedenza si credesse che solo i batteri li avessero. Si noti che questo sistema occupa una posizione intermedia tra i sottotipi IIC e IIB e può servire come difesa contro i geni parassiti "saltellanti" (trasposoni) che entrano nel microrganismo da altri archei. Un tentativo di riprodurre l'attività di CRISPR / Cas9 archeologico in E. coli (Escherichia coli) non ha portato a nulla, il che indica l'esistenza di alcuni ulteriori meccanismi specifici che regolano il sistema.
Nuovi tipi di sistemi all'interno della seconda classe, CRISPR / CasX e CRISPR / CasY, sono stati isolati anche dai batteri che vivono nelle acque sotterranee e nei sedimenti. Il sistema CRISPR / CasX include le proteine Cas1, Cas2, Cas4 e CasX. Quest'ultimo, come dimostrato dagli esperimenti su E. coli, si distingue per l'attività nucleasica, cioè è in grado di scindere DNA estraneo come Cas9. Tuttavia, questo accade solo se la sequenza TTCN è davanti ai protospacer, dove N è uno dei quattro nucleotidi. Tali sequenze sono chiamate PAM (motivo adiacente protospacer - motivo adiacente al protospacer). Il sistema CRISPR / Cas9 ha anche il proprio PAM - NGG, che dovrebbe essere posizionato dopo il protospacer. Inoltre, CRISPR / CasY è in grado di tagliare il DNA se è presente una sequenza TA PAM vicino al sito target.
Qual è la promessa di questa scoperta? Il fatto è che i sistemi rilevati sono i più compatti conosciuti al momento. Secondo gli scienziati, la piccola quantità di proteine necessarie per il loro lavoro rende CRISPR / CasX e CRISPR / CasY strumenti convenienti per l'editing del DNA. Inoltre, studi metagenomici, in cui si studia il DNA ottenuto dall'ambiente, riveleranno altri tipi di sistemi CRISPR utili per l'ingegneria genetica.
Il percorso verso l'eccellenza
Naturalmente, esiste un'alternativa alla ricerca di sistemi CRISPR in natura, migliorando la tecnologia CRISPR / Cas9 già esistente. Nonostante la sua elevata precisione, commette errori tagliando il DNA nel posto sbagliato. Ciò rende difficile apportare le modifiche corrette ai geni e quindi trattare efficacemente le malattie ereditarie. Pertanto, gli scienziati stanno cercando modi per migliorare le prestazioni del sistema. Nel 2016, ci sono stati molti articoli scientifici dedicati alla modifica di CRISPR e alla sua trasformazione in vari strumenti genetici.
Proteina Cas9 e crRNA - i componenti principali del sistema CRISPR
Immagine: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
Così, l'8 dicembre, la rivista Cell ha pubblicato un articolo di scienziati dell'Università di Toronto, che hanno creato "anti-CRISPR", un sistema che disattiva il meccanismo in determinate condizioni. Ciò consente di sopprimere l'attività Cas9 se l'RNA guida si lega al frammento sbagliato e previene gli errori. Anti-CRISPR è composto da tre proteine che inibiscono la nucleasi. Naturalmente, inizialmente non è stato inventato dagli scienziati, ma dai virus, che hanno così neutralizzato l'immunità dei batteri.
A giugno, i ricercatori americani, insieme a colleghi russi, hanno confermato che il sistema CRISPR / C2c2, ottenuto dal fusobacterium Leptotrichia shahii, è in grado di scindere l'RNA a filamento singolo. Di conseguenza, il sistema CRISPR può essere utilizzato per eliminare - sopprimere le funzioni - dell'RNA messaggero, che trasporta le informazioni dai geni ai ribosomi, dove le proteine vengono sintetizzate sulla sua base.
A maggio, i ricercatori dell'Università della California hanno creato la tecnologia CRISPR-EZ, che consente di inserire nuove molecole di DNA nei genomi degli embrioni di topo con quasi il cento per cento di successo. Il sistema CRISPR / Cas9 viene introdotto nelle uova di animali fecondate utilizzando un ago microscopico e una piccola scarica elettrica. Nel loro esperimento, gli scienziati sono riusciti a introdurre una mutazione in un gene nell'88% dei topi. Questo supera il numero di topi geneticamente modificati prodotti dall'editing CRISPR, che utilizza iniezioni convenzionali.
Ad aprile, utilizzando una variante mutante di Cas9 priva di attività nucleasica, i biologi molecolari della University of Massachusetts School of Medicine hanno sviluppato la tecnologia CRISPRainbow. L'RNA guida, che indica dove si attaccano gli enzimi, conteneva etichette fluorescenti, che consentono, ad esempio, di tracciare il movimento di elementi genetici mobili.
La zanzara anofele potrebbe essere la prima vittima dei sistemi CRISPR
Foto: Jim Gathany / Wikipedia
Nuovo mondo
Gli scienziati stanno già utilizzando i sistemi CRISPR per creare organismi geneticamente modificati, come le zanzare della malaria, che diffondono geni dannosi tra i loro parenti selvatici. Questo metodo è chiamato gene drive. Se uno dei genitori di un individuo era portatore di un gene mutante, lo trasmetterà alla sua prole con una probabilità del 50%. Questo perché il genitore ha due copie del gene e solo una di esse è difettosa. CRISPR è in grado di copiare un frammento mutante e inserirlo in un gene sano. Di conseguenza, la prole ottiene una mutazione con una probabilità del 100%.
Nel 2016, gli esperti del Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) hanno approvato una domanda dell'Università della Pennsylvania per condurre test sulla modificazione genetica umana utilizzando la tecnologia CRISPR / Cas9.
Tuttavia, sono stati superati dai cinesi. A novembre, la rivista Nature ha riferito che gli scienziati cinesi per la prima volta hanno introdotto negli esseri umani cellule con geni modificati dal sistema CRISPR / Cas9. I ricercatori hanno estratto le cellule immunitarie (linfociti T) dal sangue di un paziente con carcinoma polmonare metastatico, quindi hanno utilizzato la tecnologia CRISPR per disattivare il gene che codifica per la proteina PD-1. Quest'ultimo ha dimostrato di sopprimere l'immunità promuovendo la crescita del tumore. Gli scienziati hanno coltivato le cellule modificate, aumentandone il numero e quindi iniettandole nuovamente nel corpo umano. Resta da vedere se la terapia genica farà fronte alla malattia.
I sistemi CRISPR possono essere utilizzati anche per combattere l'HIV e le malattie ereditarie umane. Tuttavia, sono necessarie ulteriori ricerche per sviluppare trattamenti efficaci. Ovviamente non stiamo parlando di mutanti, come nei film di fantascienza, ma gli scienziati saranno in grado di creare rapidamente organismi geneticamente modificati, ad esempio piante agricole resistenti ai parassiti. Resta da vedere perché gli scienziati che hanno scoperto CRISPR e hanno capito come potrebbe essere utilizzato non hanno ancora vinto il premio Nobel.
Alexander Enikeev
